间质干细胞移植修复脊髓损伤从基础研究到

本文原载于《中华骨科杂志》年第6期

脊髓损伤（SpinalCordInjury,SCI）是一类通常由创伤所致感觉障碍及运动功能受损的临床常见疾病。随着医疗技术的进步，SCI后的死亡率已显著降低，但仍有33.3%~66.7%的SCI患者在就医途中死亡[1]。根据Ning等[2]在年进行的亚洲脊髓损伤的流行病学研究、Fehlings等[3]在年进行的全球脊髓损伤系统搜索研究和Varma等[4]年进行的综述分析研究，发现目前SCI全球发病率为15~40例/百万人，交通事故成为造成SCI的首要致病原因，患者平均年龄为37.1岁，男性发病率为女性发病率的3~4倍，而由SCI导致的全球经济损耗每年超过40亿美元[2,3,4]。SCI及其二次损伤的病理生理改变可直接导致器官功能障碍、组织坏死、感觉和运动功能的不可逆病变等。

为了抑制二次损伤和修复受损的中枢神经系统，国内外学者开展了广泛的探索与尝试，治疗手段包括药物治疗、手术减压、生物材料移植、外周神经移植等方法，然而，这些方法只能在一定程度上缓解二次损伤并修复受损神经，其临床疗效并不满意[4]。因此SCI一直以来都是研究热点和难点。

间质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）具有机体内分布广、分化潜能强、分离难度低、体外保存扩增易操作及可避免伦理道德等特点，因此受到国内外广大学者的。MSCs移植修复SCI自年Satake等的研究以来[5]，在动物水平已取得了一系列可喜的结果，为SCI患者和家庭带来新的希望。近三年来，MSCs移植在SCI的修复研究过程中取得了重要进展，随着多项Ⅰ期、Ⅱ期临床试验的结束，已有临床报道提示MSCs在临床转化方面具有良好的应用前景。

本文以"spinalcordinjury"及"Mesenchymalstemcells"为外文关键词，检索Pubmed数据库，收集年1月至年12月公开发表的相关文献共篇。设定文献纳入标准：①间质干细胞移植修复SCI研究领域的临床报道；②符合知情同意和临床伦理要求的报道研究。设定文献排除标准：①排除个案报道；②排除间质干细胞移植的基础研究；③排除同一作者团队早期重复研究；④排除综述文献及Meta分析。最终选取9篇文献总结、归纳，对间质干细胞移植修复SCI从基础研究到临床转化以及其发展前景做系统综述。

一、脊髓损伤病理生理改变

SCI病理生理改变主要发生在两个过程：即初损伤过程和二次损伤过程（图1）。SCI的初损伤主要以机械性物理损伤为主，外界暴力对脊髓中轴突、神经元、血管、血脊髓屏障等造成直接破坏[5]。二次损伤具有病变复杂、多分期、损伤剧烈等特点，同时损伤局部微环境发生剧变，抑制了轴突再生延展、复髓鞘形成、营养因子分泌、血肿清除、血管重建等活动。值得注意的是，在临床病例中，极少见脊髓完全横断损伤的病例，在损伤区域或多或少都会残留一些未被损伤的轴突及神经连接，然而这些残存的轴突在二次损伤过程中将发生脱髓鞘病变，从而失去功能[6]。因此，目前众多针对SCI修复手段都集中在抑制二次损伤病变的过程中[4]。

图1

脊髓损伤病理生理改变主要分为初损伤过程和二次损伤过程，初损伤以机械性物理损伤为主，外界暴力对脊髓中轴突、神经元、血管、血脊髓屏障等造成直接破坏；二次损伤病变复杂、多分期、损伤剧烈，同时损伤局部微环境发生剧变，抑制轴突再生延展、复髓鞘形成、营养因子分泌、血肿清除、血管重建等活动

其中具有代表性的治疗手段是甲泼尼龙（Methylprednisolone,MP）的应用。MP是目前唯一被FDA批准的治疗SCI的药物，然而已有报道表明其远期疗效非常有限[7]，甚至最新报道提出考虑到MP对远期治疗产生不利因素，不推荐SCI后应用MP[8]。另外，神经节苷酯、三七总皂甙、神经营养药物及脱水药物等均被报告在治疗脊髓损伤时有一定效果，但是其明确的疗效有待进一步观察[9,10]。近年来随着干细胞移植的研究不断深入，尤其是针对MSCs研究的探索深化，引起了广大学者的。

二、间质干细胞移植修复SCI现状

近年来，一些学者报告了他们在临床试验中MSCs修复SCI的成果，这标志着MSCs修复SCI已开始逐步从基础试验阶段转化到了临床试验阶段。

脊髓损伤的临床试验（Clinicaltrials）包括四个阶段[11]：第一期，毒副作用及安全性研究阶段；第二期，治疗手段的有效性探索阶段；第三期，治疗确认、疗效定性研究阶段；第四期，治疗使用推广阶段。根据在clinicaltrials.gov的查询结果，截止日前，共有19项关于间质干细胞临床试验的研究正在进行或已完成（表1），这些项目涵盖了临床试验的各个阶段并且其数量在不断增长。目前MSCs修复SCI的临床试验为全球热点，在我国进行的临床试验为5项，其中Ⅰ期临床试验2项，Ⅱ期临床试验1项，Ⅲ期临床试验2项。目前，世界范围内已完成的临床试验多以I期临床试验为主（5项），正在进行的临床试验多以Ⅱ、Ⅲ期临床为主，这意味着国内外学者已经在MSCs修复SCI的研究领域中迈向了新的高度，同时我国在该研究领域也处在十分重要的位置。

间质干细胞修复脊髓损伤临床试验项目

近三年来，共有9篇临床研究新近发表[12,13,14,15,16,17,18,19,20]，这些临床报道主要验证了MSCs修复SCI髓内移植的安全性，同时有部分临床报道验证了MSCs的修复SCI的有效性。

Karamouzian等[17]在年采用了腰椎穿刺法将自体骨髓间质干细胞（细胞量为7×~1.2×）移植入11例亚急性SCI患者的脑脊液中，随访12~33个月后所有患者无并发症出现，然而治疗组中仅有5例有ASIA分级改善：由治疗前的ASIA分级A级转变为治疗后的ASIA分级C级（45.5%），相较对照组（15%）却无统计学差异。同年报道中，ParkJH等[18]也对10例SCI患者进行了自体骨髓间质干细胞移植，采用了外科暴露后脊髓损伤处多点移植法（细胞量4×）联合术后腰椎穿刺法（伤后4周、8周分别移植一次，每次细胞量5×），在长期随访过程中，1名患者死亡（呼吸道感染），4名患者随访失败，2名患者无明显好转，3名患者出现了不同程度的ASIA分级改善。虽然这些研究中患者的好转率有限，但是它们都达到了Ⅰ期临床试验的目的：证明自体骨髓间质干细胞脊髓内移植的安全性。

随后于年我国学者Dai等[19]报道采用了自体骨髓间质干细胞移植入脊髓损伤区域周围的方式，针对40例SCI患者进行移植后短期随访（6个月）研究，结果表明移植组10例患者出现了不同程度的功能、感觉改善，9例获得AISA分级改善，所有患者在随访期未出现移植后并发症。同年，Amr等[16]报告了采用自体外周神经移植联合骨髓间质干细胞移植，同时采用脱乙酰壳多糖-层粘连蛋白（chitosan-laminin）支架填补脊髓损伤缺损区域的方式，针对14例慢性SCI患者进行治疗，结果表明2例出现显著感觉运动平面和痉挛状况改善，12例出现一般感觉运动平面和痉挛状况改善，其认为分析造成这样结果差异的主要原因是由于SCI造成的损伤区域远端和近端都存在着不同程度的胶质增生，这些增生的胶质无法以手术方式干预，从而影响了患者的远期康复。该研究中，13例由于术后血肿和积液的原因出现了不同程度的延期愈合。

Cheng等[15]在年采用脐带间质干细胞（2×）针对10例SCI患者进行移植，旨在治疗胸段SCI后患者并发症。结果发现，7例出现了不同程度的运动和痉挛状况改善，脐带间质干细胞移植效果优于单纯康复治疗。细胞移植并发症方面，1例出现移植后神经痛症状，术后24h减轻，分析造成疼痛的原因是由于脊髓损伤后，髓内神经产生粘连，移植过程中刺激了这些粘连神经所致。Mendon?a等[14]也报告了采用自体骨髓间质干细胞（细胞量1×）治疗慢性SCI患者的I期临床试验结果，发现14例慢性SCI患者（ASIA评分A级）经髓内移植自体骨髓间质干细胞无并发症出现，7例出现了AISA分级改善，9例出现不同程度的排尿功能改善，1例出现感觉诱发电位显著改善。

三、间质干细胞分类

间质干细胞广泛存在于结缔组织和器官间质中，包括骨髓、脂肪、胎盘组织、肌肉组织、牙齿、脐带组织和脐带血等，针对不同组织，经过特定的抽取、提纯、培养，均可以得到稳定传代的MSCs。根据MSCs的来源可分为两类：成熟组织来源的MSCs和围产期组织来源的MSCs[20]。成熟组织来源的MSCs主要包括骨髓间质干细胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMSCs）和脂肪源间质干细胞（AdiposetissueDerivedMesenchymalCells,ADMSCs）；围产期组织来源的MSCs主要包括脐带间质干细胞（UmbilicalCordMesenchymalStemCells,UCMSCs）、脐带血间质干细胞（Umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells,UCBMSCs）、胎盘间质干细胞（PlacentaDerivedMesenchymalStemCells,PDMSCs）、羊水间质干细胞（AmnioticFluidDerivedMesenchymalStemCells,AFDMSCs）。

由于上述MSCs的来源不同，故其分离方式和细胞特点也具有一定的差异。值得一提的是，考虑到自体细胞移植、操作易行性、免疫排斥反应和伦理道德等因素，目前围绕着成熟组织来源的MSCs的研究偏多[16,17,18,19,20]。其中，上述19项SCI临床试验中（表1），有14项是针对BMSCs的临床应用探索所展开的。

四、间质干细胞作用机制

（一）替代和桥接作用

MSCs移植后可以分化成为神经样细胞，从而取代已凋亡的神经细胞，与残存的神经细胞进行重新连接[14]，我们的研究团队未发表的研究成果也验证了MSCs的这一作用（图2）。同时，损伤局部移植的MSCs还可以起到桥接作用，从而填补由损伤造成的神经组织空洞，为SCI后宿主轴突的再生提供一个桥接通道，为局部损伤的近、远残端重新建立神经突触连接创造有利条件[16]。

图2

移植后的BMSCs分化成为神经样细胞并取代凋亡的宿主神经细胞　A　大鼠慢性脊髓损伤（挫裂伤）4周后行局部BMSCs移植，移植8周后处死，取材后行震荡切片并行GFAP、Nestin免疫组化验查，于镜下观察。示宿主凋亡的神经细胞,示损伤后高表达的胶质瘢痕，示损伤区域损伤空洞，示由BMSCs分化的神经样细胞和再生轴突　B　3D全层扫描A图所示神经样细胞，可观察到清晰的该神经样细胞再生的轴突

（二）旁分泌和微环境改善作用

MSCs移植可以显著提高损伤局部生长因子的表达，近年来已被证实可被影响表达的因子包括：脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF）、神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）、神经营养因子3（neurotrophin3,NT-3）等[21]。并可以同时调控巨噬细胞，降低损伤局部炎症反应，从而对损伤局部的微环境进行改善，便于SCI后损伤局部轴突延展，重建伤后神经连接和血管网[22]。

（三）诱导分化作用

中枢神经系统存在一定的自我修复能力，而移植的MSCs可以通过减少局部神经抑制因子的表达，诱导宿主神经干细胞向神经元方向分化，促进自我修复的过程[23]。

五、间质干细胞移植修复脊髓损伤存在的问题及未来方向

从本文可见，MSCs移植修复SCI的研究正在不断深化，这一治疗方案也得到了全世界学者的。但是，既往的研究主要集中在基础领域，临床试验经验和成果有限，多数临床试验只能基于基础研究的成果，然而由于动物和人的差异性，想做到真正的从基础研究转化成临床不得不面临大量的问题，以下几个问题已成为了这一领域近年来的点。

（一）MSCs移植量

自年迄今，根据pubmed数据库，围绕MSCs移植修复SCI的报道共有98篇，基础研究75篇，临床研究20篇，这其中以BMSCs移植的报道最多。然而在各个报道中，无论是基础研究还是临床研究，即使采用了同样的动物模型和细胞类型，或是纳入了同样节段损伤的SCI病例，各个学者所采用的MSCs移植量却不尽相同[12,13,14,15,16,17,18,19,20]，以大鼠挫裂伤模型的基础研究为例[24,25]，BMSCs工作浓度从1×到1×，其用量从4×到1×，尚未建立一个应用标准。然而，同样的问题在临床研究中也存在着，BMSCs应用细胞量从7×到5×不等[14,16,17,18,19,20]。迄今为止，尚没有针对浓度和剂量的系统对比研究的报道。然而，针对SCI不同类型和程度选择一个合适的细胞浓度和数量，既可以保证MSCs移植后的存活率，又可以保证其分化、旁分泌效率，这对MSCs移植的临床转化至关重要。

（二）MSCs移植时间点

目前针对MSCs的移植时间点也有较大的争议，有学者报道采用尽早的急性期移植，从而避免未损伤的轴突脱髓鞘病变，同时抑制病变局部的炎症反应，并可避免胶质瘢痕过度增生[26]。同时，SCI后尽早的进行MSCs移植，将有利于局部血管再生和血管网的重建[27]。然而，最新报道表明在SCI慢性期进行MSCs移植，同样可以取得一定的疗效，同时，慢性期移植由于局部微环境已趋于稳定，有利于MSCs的移植存活，可使MSCs的旁分泌效果最大化，从而分泌更多的神经营养因子，促进再髓鞘和轴突延展过程[21]。既往研究表明，慢性期移植同样具有降低损伤区域胶质瘢痕的效果[28]。因此，无论是在急性期还是慢性期，MSCs移植都起到一定疗效，但是最佳的MSCs移植时间点仍需进一步研究进行确定。

（三）移植途径和移植次数

目前临床较为经典的急性期移植途径是损伤区域局部移植，慢性期移植途径是损伤空洞内移植[12,13,14,15,16,17,18,19,20]，这两种方法可以保证MSCs的移植效率，同时可以准确控制移植剂量，但是其缺点在于该方法均属创伤性移植方法，都将对脊髓造成医源性的二次损伤。因此，经外周静脉移植、鞘膜下移植、经鼻腔滴鼻移植等方式近年来也逐渐被建立起来[29,30]，虽然这些方法可以避免医源性损伤，但是却很难控制MSCs的移植效率和剂量，未来仍需进一步的研究。

干细胞移植次数的增加会提高移植效率从而提升临床疗效，然而，多次（≥2）细胞移植同时也会增加神经组织的医源性二次损伤和患者的痛苦和经济负担。同时，有学者提出，如采用蛛网膜下腔注射的方式，为保证BMSCs的最佳存活率和迁移率，相较1次（伤后1周、3周）、2次（伤后1周、3周和5周）和5次移植（伤后1周、3周、5周、7周、9周），最佳移植次数为3次（伤后1周、3周和5周）[31]。因此，在未来采用多途径、多层面、多时间点联合应用的移植方式应该是一个通过MSCs修复SCI策略方向。

考虑到脊髓损伤后复杂的病理生理改变，单一的治疗方式难以使达到满意的临床疗效。近来有最新报道提示采用联合移植相较单一移植的方式似乎具有更多优势：①通过和生化材料的联合移植方式可以显著提高MSCs移植的存活率，并且可以进一步抑制损伤局部的炎症反应[32]；②通过多种类型的MSCs移植，可以充分发挥不同类型MSCs的优势；③通过自体外周神经组织的联合移植，可以加速损伤局部轴突生长[16]；④通过MSCs和其他类型的干细胞/细胞移植，可以提高干细胞移植的疗效[33,34]。

（四）脊髓损伤的疗效评估

从上述临床试验和最新文献可见，目前在脊髓损伤的诊断及疗效评估过程中所采取的评价手段是多元的，包括影像学评价、电生理评价、神经功能评价、疼痛评价和心理健康评估。传统的单纯神经功能学评价，如弗兰克尔分级（FrankleGrading）和ASIA分级，随着SCI研究的深入，其局限性逐渐显现，目前需要一套能够更细致客观评定SCI分级程度和神经功能恢复的方法。因此，欧洲脊髓损伤中心学者提出采用联合体感诱发电位、运动诱发电位和交感皮肤反应检测共同评定[35]。在影像学评价方面，随着影像技术的长足发展，可结合功能性磁共振成像技术和弥散张量成像定量精确显示SCI程度和范围，从而为SCI的诊断、治疗、疗效评估提供更加客观的依据[36]。

我们认为，目前MSCs移植仍有众多重要问题尚无解答，移植剂量、移植时间点和移植途径尚未确定，联合移植涉及到生化材料安全性、联合细胞移植的浓度比例、所联合的其他类型细胞的伦理道德等问题无疑都进一步加大了临床转化难度，这些将需要更多的探讨和研究。在未来，结合更多临床试验的成果，有针对性的开展联合移植的研究或是一种修复SCI的新策略。

间质干细胞问世已近25年，纵观近10年干细胞修复SCI研究，MSCs移植修复SCI得到了广泛，结合SCI后生理病理改变，可将原因概括如图1[21,37,38]。随着多项基础研究和临床试验的结束MSCs移植修复SCI的神秘面纱正逐渐被掀开，人们对于干细胞移植技术和中枢神经损伤修复的认识也不断深入，但是如何能顺利的将该技术成功转化到临床仍面临着诸多挑战。从近三年该技术的迅猛发展速度，我们有理由相信在不远的未来，经过全世界学者和患者的共同努力，MSCs移植修复SCI将会给人们带来新的惊喜。

图3

间质干细胞（MSCs）修复SCI病理生理改变机制流程图：MSCs通过替代和桥接、改善旁分泌和微环境以及诱导分化以修复SCI

参考文献（略）

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